Anonymous User
Login / Registration

Gastroenterologie
a hepatologie

Gastroenterology and Hepatology

Čes a Slov Gastroent a Hepatol 2007; 61(2): 86-89.

CFTR mutations in patients with endoultrasound (EUS) signs of chronic pancreatitis and increased serum amylase

Ivo Novotný1, Arona Ševčíková2, Renata Gaillyová Orcid.org  3, Jan Trna Orcid.org  4, Miroslava Beňovská, Petr Dítě Orcid.org  5,6, Iveta Valášková Orcid.org  

+ Affiliation

Summary

SUMMARY

Novotný I, Ševčíková A, Valáškova I, Gaillyová R, Trna J, Beňovská M, Dítě P. CFTR mutations in patients with endoultrasound (EUS) signs of chronic pancreatitis and increased serum amylase

The aim of the study: Isolated idiopathic hyperamylasaemia was described in year 2000. The occurence of that phenomenon is sporadic, but sometimes familial and question about its genetic origin was raised. CFTR mutation is more often described in patients suffering from so called idiopathic chronic pancreatitis.

Material and methods: In our study 68 patients with high serum amylase were investigated.

Results: Suspition to chronic pancreatitis was provided by EUS criteria according to Wiersema. In this group 7.3 % (5 pts) CFTR mutation was found.

Conclusion: We consider that patients with high serum amylase which origin is not clear a detailed investigation is reccomended including genetic markers of chronic pancreatitis.

Key words: CFTR mutation - EUS - hyperamylasaemia - chronic pancreatitis.

ÚVOD

Izolovanou idiopatickou hyperamylazémii popsal Gullo v roce 2000 (1) , a to bez průkazu současně probíhajícího pankreatického onemocnění. Výskyt hyperamylazémie byl popsán jako rodinný nebo jako sporadický s tím, že přesná etiologie hyperamylazémie nebyla identifikována. Výskyt u rodinných příslušníků nastolil otázku podílu genetických aberací u idiopatické hyperamylazémie.

Hereditární pankreatitida patří mezi závažné formy chronické pankreatitidy díky tomu, že u těchto nemocných jedinců je riziko vzniku pankreatického karcinomu 60-80x častější než u běžné populace. V roce 1996 byla D. Whitcombem identifikována mutace genu, označená PRSS1 pro kationický trypsinogen (2) . Průkazy defektní inhibice trypsinogenu a trypsinu u osob s chronicku pankreatitidou podporují hypotézu, že anomální aktivace pankreatických proenzymů na aktivní enzymy v pankreatickém parenchymu jsou spouštěcím mechanizmem zánětlivých procesů. Současná data ukazují, že chronická pankreatitida může být nemocí geneticky indukovanou, a proto i genetické testování nemocných s chronickou pankreatitidou je neodmyslitelnou součástí diagnostického algorytmu chronické pankreatitidy současnosti (3) .

V naší již publikované studii jsme v souboru 40 osob iniciálně vyšetřených pro nejasné dyspeptické symptomy (4) nalezli častější výskyt hyperamylazémie, zvláště pankreatického izoenzymu a současně morfologická kritéria chronické pankreatitidy dle endosonografie (5,6) a tyto osoby zařadili do skupiny idiopatické pankreatitidy.

Proto jsme u souboru 68 osob, u nichž byla nalezena hyperamylazémie a při endosonografickém vyšetření splněna více než tři Wiersemova kritéria chronické pankreatitidy (7) , zjiš»ovali výskyt mutací CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), protože 25-30% osob s idiopatickou chronickou pankreatitidou jsou nositeli mutace na jedné nebo obou alelách genu CFTR. Doposud bylo v genu CFTR identifikováno více než 1500 mutací. Většina z nich je však raritní a privátní. Z celkového počtu 30 doposud u nás nalezených mutací (zahrnujících celkem 95 % všech CF alel) se pouze 8 mutací vyskytuje na více než 1 % CF patologických alel (8) . Nejčastější CF mutace v českém regionu je F508del, která se vyskytuje na asi 70% CF patologických alel. Další časté mutace jsou: CFTRde-le2,3(21kb), G542X, G551D, N1303K a R553X. Tyto mutace jsou pro svoji vyšší frekvenci (dohromady jsou přítomny na 85 % CF patologických alel v populaci) zahrnuty do prováděné analýzy genu CFTR.

MATERIÁL A METODIKA

Do souboru vyšetřených osob bylo zařazeno celkem 68 osob, z toho 36 mužů a 32 žen, průměrného věku 36 let (21-66 let).

Všechny osoby byly vyšetřeny z důvodu etiologicky nejasných a necharakteristických dyspeptických potíží, bez známek onemocnění jícnu, žaludku, střev, biliárního systému a jater (pomocí anamnestických dat, hodnocení jaterních testů, testů, funkce ledvin, břišní sonografie a endoskopie). Nikdo ze sledovaných nebyl léčen s mukoviscidózou nebo endokrinopatií. U všech osob byla prokázána hyperamylazémie, a to opakovaně v období delším než 1 rok.

Ke stanovení přítomnosti CFTR mutací byla použita metoda analýza teploty tání hybridizačních sond po vysokofrekvenční PCR na real-time PCR (přístroj Light-Cycler-Roche) Real-time PCR je založena na flourescenčně značených specifických sondách FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), které emitují záření pouze v případě specifické vazby na templát(9) . Hybridizační proby FRET pro stanovení jednoho selektovaného molekulárního markeru sestávají ze dvou sekvenčně odlišných oligonukleotidů, hybridizujících k interní sekvenci amplifikovaného fragmentu během annealingové fáze PCR. Jedna z obou prob je značena na 5' konci LC Red Fluoroforem a 3' konec má ošetřen fosforylací, aby bylo zabráněno nežádoucímu prodlužování DNA řetězce. Druhá FRET próba je značena pouze na svém 3' konci fluoresceinem. Po každé hybridizaci, kdy jsou próby ve vzájemné těsné blízkosti (odděleny pouze 1-5 nukleotidy na templátu), dochází k přenosu fluorescenční resonanční energie mezi oběma fluorofory. Během FRET, fluorescein (donorový fluorofor) je excitován světelným zdrojem přístroje a část excitační energie je přenesena na LC Red (akceptorový fluorofor). Emitovaná fluorescence tohoto akceptorového fluoroforu byla v reálném čase vyhodnocována.

Vlastní metodika spočívá v řadě dílčích kroků: izolace DNA z lymfocytů periferní krve pomocí automatického izolátoru BioRobot EZ, vlastní real-time PCR cílové DNA sekvence pomocí specificky navržených primerů (ohraničujících místo mutace v příslušném genu) a FRET sond, následuje analýza teploty tání nasyntetizovaných PCR produktů.

Pokud tímto testem byla potvrzena u některého z pacientů jedna CF patologická alela, pokračovali jsme v analýze genu CFTR s cílem potvrdit nebo s co nejvyšší pravděpodobností vyloučit nosičství druhé CF patologické alely Byl použit hybridizační kit INNO-LiPA CFTR19 a INNO-LiPA17+Tn Update (Innogenetics) k součastné detekci aidentifikaci 36 mutací (F508del, CFTRdele2,3 (21kb), G542X, N1303K, W1282X, G551D, 1717-1 GtoA, R553X, I507del, 711+lGtoT, 3272-26AtoG, 3905insT, R560T, 1898+lGtoA, S1251N, I148T, 3199del6, 3120+lGtoA, Q552X, 394delTT, G85E, 621+1 GtoT, R117H, 1078delT, R347P, R334W, E60X, 711+5 GtoA, 2789+5 GtoA, R1162X, 3659-delC, 3849+lOkb CtoT, 2143delT, A455E, 2183AA-toG, 2184delA) a polytymidinových variant (Tn) v intronu 8. Tyto mutace představují cca 95% CF patologických alel detekovaných v naší populaci.

CSGH

Amylazémie byla stanovena fotometrickou metodou(10). Normální hodnota amylazémie v krevním séru je do 1,0 μkal/l. Průměrná hodnota u celkové amylazémii námi hodnoceného souboru byla zvýšena a činila 1,92 μkat/l (1,22-2,64).

V souboru 68 vyšetřených s hyperamylazémií a více než třemi Wiersemovými endosonografickými kritérii, byla CFTR mutace prokázána u 5 osob (7,3 %). Výsledky ukazuje tabulka 1.

Nález mutace byl prokázán u tří mužů a dvou žen. U všech 5 nemocných se jednalo o mutaci F508del. Průměrný věk u osob s CFTR mutací činil 49,6 roku (25-66), tj. byl vyšší než věk celého vyšetřeného souboru.

DISKUZE

Idiopatická pankreatitida stále činí 10-20% všech chronických pankreatitid, při incidenci 5-23 nových případů chronické pankreatitidy na 100 000 obyvatel za kalendářní rok(11).

V posledních letech byla publikována řada studií, prokazujících nález mutace CFTR u osob s diagnózou idiopatické chronické pankreatitidy (12, 14) i u nemocných s chronickou pankreatitidou etiologie alkoholické. Weiss et al. (15) vyšetřili soubor osob s idiopatickou chronickou pankreatitidou a kontrolní skupinu. Vyloučeny ze studie byly osoby s anamnézou pravidelného pití alkoholu, biliárním, metabolickýmneboendokrinologickým onemocněním v anamnéze a osoby s manifestním plicním onemocněním a mukoviscidózou. Rovněž nemocní s nálezem PRSS1 genu nebyli hodnoceni. U 67 osob s idiopatickou pankreatitidou nalezli 25 abnormal nich CFTR alel (37,3%), oproti 11 abnormálním CFTR alelám u kontrolní skupiny. Podobně Ockenga et al. (12) nalezli u 20 osob s idiopatickou chronickou pankreatitidou u 6 nemocných jednu CFTI mutaci, tj. u 30% vyšetřených a v 1 případě byb prokázány mutace dvě. Je evidentní, že přítomnost CFTR mutací je faktorem zvyšujícím riziko vznikl chronické pankreatitidy (15) .

Gullo et al. (16) sledovali výskyt CFTR mutaci u osob s tzv. idiopatickou hyperamylazémií včetni hereditárního výskytu. Domnívají se, že genetické abnormality, v daném případě CFTR mutace, se podílí na vzniku této benigní hyperamylazémie Problematika přesné diagnostiky pankreatopatidy u osob s opakovanou a dlouhodobou hyperamyla zémií bez typických klinických příznaků chronické pankreatitidy je obtížná. My jsme publikovali soubor 40 osob, které byly vyšetřeny z důvodu dyspeptického syndromu (pocity tlaku v epigastriu, předčasná sytost, flatulence) a vyšetřili sérovoi amylazémii a pankreatický izoenzym (4) . Všem těm to osobám bylo provedeno endosonografické vyšetření a vyšetření břišní sonografií. U žádného z vyšetřených nebyly zjištěny biochemické známky onemocnění biliárního systému a jater. Nalezli jsmi u 20 vyšetřených osob s hyperamylazémií (50% endosonografické známky chronické pankreatitid) následně ověřené ERCP - dle cambridgské klasifikace změny 1.-2. stupně. V současné studii jsmi u osob s hyperamylazémií a endosonografickým známky chronické pankreatitidy dle Wiersemy nalezli přítomnost CFTR mutace u 5 osob z celkového souboru 68 vyšetřených (7,3 %). V kontrolní skupině 50 zdravých osob byla nalezena CFTR mutaci pouze u 1 z vyšetřených. V naprosté většině CFTI pozitivních osob byla prokázána mutace F508del což je v korelaci s její výraznou prevalencí na Cl patologických alelách oproti jiným mutacím. Výsledky podporované nálezy výskytu CFTR mutaci u osob s idiopatickou chronickou pankreatitidoi upozorňují na potřebu detailnějšího vyšetření osob s "nejasnou" hyperamylazémií. Dlouhodobé sledování těchto osob může přispět ve studiu význami výskytu CFTR mutace při rozvoji chronické pankreatitidy.

Práce je součástí grantového projektu IGA MZ ČI NR 8431-3.

Literatura
  • 1. Gullo L. Familial pancreatic hyperenzynemia. Pancreas 2000; 20: 158-160.
  • 2. Whitcomb DC. Hereditary pancreatitis: A model for undestanding the genetic basis of acute andchronicpancreatitis. Pancrea-tology2001; 1:565-570.
  • 3. Witt H. Chronic pancreatitis and cystic fibrosis. Gut 2003; 52 (Sup-pi 11): ii31-ii41.
  • 4. Novotný I, Dítě P, Sevčíková A, Přecechtělová M. Přínos podrobnějšího vyšetření u osob s etiologicky nejasnou dlouhodobě zvýšenou amylazémií. Čes a Slov Gastroent a Hepatol 2006; 60: 123-125.
  • 5. Kalil S, Glasbrenner B, Leodolter A, et al. EUS in the diagnosis of early chronic pancreatitis: a prospective follow-up study. Gastroint Endosc 2002; 55: 507-511.
  • 6. Kahl S, Malfertheiner P. The place of endoscopic ultrasound in the diagnosis of chronic pancreatitis. In: Enrique Domin-gues-Munoz J. Clinical Pancrea-tology, Blackwell Publ 2004.
  • 7. Wiersema MJ., Hawes RH., Lehman GA, et al. Prospective evaluation of endoscopic ultrasonography and endoscopic retrograde cholangiopancreatography in patients with chronic abdominal pain of suspected pancreatic origine. Endoscopy 1993;25:555-564.
  • 8. Estivill X, Bancells C, Ramos E, et al. Geographic Distribution and Regional Origin of 272 Cystic Fibrosis Mutation on european populations. Human Mutation 1997; 10: 135-154.
  • 9. Burggraf S, Malik N, Schuhmacher E, Olgemöller B. Rapid Screening for Five Major Cystic Fibrosis Mutation by Melting Peak Analysis Using Fluorogenic Hybridization Probes, Rapid Cycle Real-Time PCR-Methods and Applications. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag 2002; 85-94.
  • 10. Greiling H, Gressner AM, et al. Lehrbuch der Klinichen Chemie und Pathobiochemie, 3rd ed. Stuttgart, New York: Schatteuer Verlag, 1995.
  • 11. Cohn JA, Friedman KJ, Noone PG, et al. Relation between mutations of the cystic fibrosis gene and idiopathic pancreatitis. N Engl J Med 1998; 339: 653-658.
  • 12. Ockenga J, Stuhrmann M, Ballmann N, et al. Mutations of the cystic fibrosis gene, but not cationictrypsinogen gene, are associated with recurrent or chronic idiopathic pancreatitis. Am J Gastroenterol 2000; 95: 2061-2067.
  • 13. Pezzilli R, Morselli-Labate AM, Mantovani V, et al. Mutations of the CFTR gene in pancreatic disease. Pancreas 2003; 27: 332-346.
  • 14. Gaia E, Salacone P, Gallo M, et al. Germline mutations in CFTR and PSTI genes in chronic pancreatitis patients. Dig Dis Sci 2002;47:2416-2421.
  • 15. Weiss FU, Simon P, Bogdanova N, et al. Complete cystic fibrosis transmembrane conductance regulater gene sequencing in patients with idiopathic chronic pancreatitis and controls. Gut 2005; 54: 1456-1460.
  • 16. Gullo L, Antovani V, Manca M, et al. Mutations of the CFTR gene in idiopathic pancreatic hyperenzymemia. Pancreas 2005; 31: 350-352.

To read this article in full, please register for free on this website.

Benefits for subscribers

Benefits for logged users

Credited self-teaching test